慢病毒包装原理解析

1 慢病毒简介

​慢病毒（Lentivirus）属是反转录病毒科（Retrovirus）下的一个属，病毒含有RNA-DNA聚合酶(RNA-directed DNA polymerase)亦即反转录酶(retrotranscriptase)做为复制之用。

2 慢病毒载体

​慢病毒载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。简单点说就是HIV的升级版，HIV只能感染CD4+T细胞，对我们实验来说肯定不行，所以需要改装让病毒感染亲嗜性增强。HIV还有一个有点就是可以将自己的基因组整合到宿主的基因组中，利用这个特性可以方便我们进行稳转细胞株的建立。

2.1 逆转录病毒分类

• 致瘤病毒（导致癌症）；
• 慢病毒（导致慢性病）；
• 泡沫病毒（不导致疾病）。

2.2 逆转录病毒基因组核心成分

• gag 包含组成病毒中心和结构的蛋白质的基因(Gag, group specific antigen)

• pol 包含逆转录酶的基因(Pol, polymerase)

• env 包含组成病毒外壳的基因(envelope)。

​Gag形成病毒核心，pol编码各种RNA相关酶，env编码外壳蛋白。

2.3 慢病毒代表HIV基因组

分类基因名初级蛋白产物成熟蛋白产物病毒结构蛋白gagGag多聚蛋白MA, CA, SP1, NC, SP2, P6polPol多聚蛋白RT, RNase H, IN, PRenvgp160gp120, gp41必要调控元件tatTatrevRev其他调控蛋白nefNefvprVprvifVifvpuVpu

table. HIV基因组编码蛋白

• Env 编码Env蛋白。该蛋白包括包膜糖蛋白前体gp160、包膜糖蛋白gp120和gp41。gp160在蛋白酶作用下分解为gp120和gp41两种包膜糖蛋白。gp120暴露于病毒包膜之外称外膜蛋白，感染细胞时可与细胞的CD4受体蛋白结合；gp41称跨膜蛋白，镶嵌于病毒包膜脂质中。

• RT 逆转录酶

• RNase H RNA酶

• IN 整合酶

• PR 蛋白酶

• **Tat ** 调节病毒RNA基因组的反转录，确保有效的合成mRNA，并调节细胞释放病毒颗粒，是HIV-1复制所必需的转录激活因子。Tat蛋白是一种反式激活因子，与LTR上的应答元件结合后能启动及促进病毒基因的mRNA 转录。

• Rev 调节病毒蛋白的表达，Rev是HIV-1复制所必需的，缺少Rev功能的前病毒具有转录活性，但不能表达晚期基因，不能产生病毒粒子。

• LTR 长末端重复序列（LTR），反转录病毒的基因组的两端各有一个长末端重复序列(5' LTR和3' LTR)，不编码蛋白质，但含有启动子，增强子等调控元件。病毒利用LTR将基因组整合到宿主基因组中。

• 顺式作用元件（cis-acting element） 位于基因的旁侧，可以调控影响基因表达的核酸序列。包括启动子（promoter） 、增强子（enhancer）、应答元件（responsive elements）等。其活性只影响与其自身同处于一个DNA分子上的基因。其本身并不编码蛋白质，可以与反式作用因子相互作用参与基因表达调控。

• 反式作用因子（Trans-acting factor） 是参与调控基因转录效率的蛋白质因子，可以直接或间接识别或者结合顺式作用元件核心序列，可对基因表达产生激活或阻遏的作用。

• 反转录转座子（retrotransposon） 简称“反座子”（retroposon），是由RNA介导转座的转座子的元件，在结构和复制上与反转录病毒（retrovirus）类似，只是没有病毒感染必须的env基因，它通过转录合成mRNA，再逆转录合成新的元件整合到基因组中完成转座，每转座1次拷贝数就会增加1份，可以增强自己的基因组。因此，它是许多真核生物中数量最大的一类可活动遗传成分。在植物中特别丰富，它们是核DNA的一个主要组成部分。

  • 病毒超家族（Viral superfamily） 这类反转录转座子可以编码反转录酶(Reverse transcripatase)或整合酶(integrases)。能自主地进行转录，其转座的机制同反转录病毒相似，但不能像反转录病毒那样以独立感染的方式进行传播；具有长末端重复序列（long terminal repeats，LTR）的转座子，这也是反转录病毒基因组的特征性结构，
  • 非病毒超家族（nonviral superfamily） 自身不能编码转座酶或整合酶，只能在细胞内已有的转座酶的作用下才能进行转座；

2.4 慢病毒载体进化

2.4.1 第一代慢病毒

​第一代慢病毒载体为双质粒系统，基本保留了HIV的所有组件，产毒滴度低，复制缺陷，且存在产生复制能力的活性HIV病毒的可能；

2.4.2 第二代慢病毒

​在第一代的包装质粒上剔除一些反式作用因子，所以还是三质粒组成。其中使用水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）基因替代env基因，拓宽了病毒的感染宿主细胞范围，虽然三质粒降低了病毒重组的可能，但是由于其依然保留HIV大部分附属基因，产生活性HIV依然存在可能；

​载体质粒：插入我们的目的片段。插入的目的片段两侧有LTR，有助于整合到宿主基因组上

• 病毒包装系统
  • 转基因质粒
  • psPAX2 gag, pol, rev包装质粒
  • pMD2.G VSV-G包装质粒

2.4.3 第三代慢病毒

​第三代HIV-1来源的慢病毒载体，在第二代的包装质粒基础上，将gag和pol分散到两个质粒上，这样第三代系统由4个质粒组成。

• 病毒包装系统
  • 转基因质粒
  • pRSV-Rev 编码Rev
  • pMDLg/pRRE 编码HIV-gag， HIV-pol
  • pMD2.G 编码VSV-G